Xi Jiang

Luis Manuel Rubio Herrero y Stefan Burén

11-03-2022

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Identificación de las proteínas NifH y NifB óptimas para la ingeniería de la nitrogenasa en eucariotas

Los problemas asociados al uso masivo de fertilizantes nitrogenados sintéticos, necesarios para mantener un alto rendimiento de los cultivos, podrían aliviarse mediante la transferencia de la capacidad de fijación biológica del nitrógeno (BNF) a las especies cultivadas. La nitrogenasa, la enzima que cataliza la BNF, está formada por NifH y NifDK y requiere además al menos las proteínas NifB y NifEN, ya que éstas sintetizan el cofactor metálico del sitio activo de la nitrogenasa llamado FeMo-co. Dos componentes clave para la ingeniería de la nitrogenasa en los cultivos son la NifH, que se requiere a altas concentraciones celulares, y la NifB. Los intentos anteriores de expresar NifH y NifB en plantas se enfrentaban a problemas de solubilidad e inestabilidad. En esta tesis, establecimos una línea de trabajo para identificar las proteínas NifH y NifB adecuadas para la ingeniería de plantas y utilizarlas para obtener líneas de arroz transgénico. Se expresaron dos bibliotecas de genes que contenían 32 variantes de NifH y 30 de NifB y se dirigieron a mitocondrias de tabaco (para NifH) o a mitocondrias y cloroplastos de tabaco (para NifB). El cribado de la biblioteca de NifH en el tabaco identificó una variante de NifH de Hydrogenobacter thermophilus que se acumulaba de forma soluble y a altos niveles en las mitocondrias de la levadura, el tabaco y el arroz, y mostraba actividad in vitro cuando se purificaba de todas ellas. El cribado de NifB identificó variantes de la archaea Methanocaldococcus infernus, Methanothermobacterium thermautotrophicus y Methanosarcina acetivorans como solubles, estables y activas cuando se purificaron a partir de mitocondrias y cloroplastos de tabaco. También se generaron líneas transgénicas de arroz que acumulan NifB de M. infernus o M. thermautotrophicus en las mitocondrias, y se demostró que NifB favorece la síntesis de FeMo-co in vitro. Demostramos que es posible identificar proteínas con estabilidad y solubilidad mejoradas, mediante el cribado de bibliotecas genéticas basadas en el conocimiento que consisten en proteínas homólogas de diverso origen filogenético. La identificación y expresión de una variante de NifH, y de tres variantes de NifB, con propiedades superiores en el tabaco y el arroz, sienta las bases para la transferencia de la capacidad de fijación de nitrógeno a cultivos de interés agronómico.