Andrea Jiménez Leiva

Socorro Mesa Banqueri y María Jesús Delgado Igeño

09-07-2019

Facultad de Ciencias, Universidad de Granada

Sobresaliente cum laude

Caracterización molecular de las proteínas FixK₂ y NnrR que controlan la desnitrificación en Bradyrhizobium diazoefficiens

Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han demostrado que los genes nosRZDFYLX de Bradyrhizobium diazoefficiens que codifican la síntesis de la óxido nitroso reductasa (Nos) constituyen una unidad transcripcional única, cuya expresión depende principalmente del promotor presente en la región 5’ del gen nosR, donde se identificaron dos inicios de la trascripción, TSS₁ y TSS₂ a 84 y 57 nt del ATG, respectivamente. Estudios de actividad β-galactosidasa de una fusión transcripcional nosR–lacZ y de expresión y actividad de la enzima Nos han demostrado que las condiciones limitantes de O₂ constituyen la principal señal que induce la expresión de estos genes, siendo la proteína FixK₂ la que controla y activa directamente la transcripción del operón nosRZDFYLX in vitro.

En B. diazoefficiens, la expresión los genes de la desnitrificación está sujeto al control por dos factores transcripcionales de tipo CRP/FNR, FixK₂ y NnrR, en respuesta, respectivamente, a microoxia y óxidos de nitrógeno, en particular, óxido nítrico.  Durante el desarrollo de esta Tesis se han identificado más de 170 genes simultáneamente inducidos en condiciones desnitrificantes y bajo el control positivo de NnrR. Entre ellos, el gen cycA, que codifica el citocromo soluble c₅₅₀, previamente descrito como donador de electrones intermediario entre el complejo de membrana bc₁ y la NirK. En este trabajo, se ha podido demostrar, también, la implicación de CycA en la actividad de la enzima óxido nitroso reductasa (Nos). Cuando se profundizó en la regulación del gen cycA, además del control por NnrR, se observó un control por la proteína FixK₂ en condiciones de anoxia con nitrato, tanto a nivel transcripcional como traduccional. Es más, en ensayos de transcripción in vitro se pudo demostrar que la activación de la transcripción del gen cycA está controlada de forma directa por FixK₂. Igualmente, en este trabajo se han identificado nnrR y nnrS, un gen localizado de forma divergente a nnrR, como dianas directas de FixK₂.

Estudios in vivo llevados a cabo con el objeto de profundizar en el mecanismo molecular del regulador NnrR revelaron la implicación del hemo como cofactor de NnrR. La implicación del hemo como cofactor de NnrR también se estudió en ensayos in vitro. De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede proponer que el hemo es el cofactor más probable de NnrR que interviene en el mecanismo de detección de NO.

Finalmente, en esta Tesis se han identificado los determinantes moleculares de la interacción discriminatoria de las proteínas FixK₂ y NnrR con sus secuencias de reconocimiento (caja FixK₂, caja NnrR). En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral contribuyen a aumentar el conocimiento relacionado con la regulación de la desnitrificación en B. diazoefficiens, rizobio modelo para el estudio de dicho proceso. Concretamente, se ha avanzado en el mecanismo molecular implicado en el control de la desnitrificación mediado por las proteínas FixK₂ y NnrR. Esto ha permitido identificar un solo nucleótido en la secuencia de reconocimiento de ADN como residuo clave para la modulación por la proteína FixK₂. del metabolismo microóxico o desnitrificante de B. diazoefficiens.