Álvaro Eseverri Sabaté

Luis Manuel Rubio Herrero y Elena Caro Bernat

01-03-2021

Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Alimentaria y de Biosistemas. Universidad Politécnica de Madrid

Sobresaliente cum laude

Esfuerzos de la biología sintética en la ingeniería de la biosíntesis de la proteína nitrogenasa Fe en los plastos

La generación de cultivos capaces de llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno es un desafío que podría conducir a una nueva revolución agrícola. Un posible enfoque para la generación de estos cultivos se basa en la transferencia directa de genes bacterianos nif, necesarios para la biogénesis de la nitrogenasa, al genoma de la planta. Los cloroplastos de plantas podrían albergar una enzima nitrogenasa activa, ya que contienen poder reductor y abundancia de ATP, a pesar de la presencia de oxígeno. Este trabajo presenta el uso de herramientas de biología sintética para optimizar la producción de la proteína de hierro de la nitrogenasa (NifH) en cloroplastos de Nicotiana benthamiana. Los genes nifH, M, U y S de Azotobacter vinelandii se rediseñaron para aumentar la acumulación de sus proteínas en células de tabaco, y su importación al cloroplasto se optimizó mediante péptidos de tránsito que funcionaran correctamente para cada proteína Nif. La proteína NifM, una supuesta peptidil-prolil cis-trans isomerasa, fue necesaria para la obtención de proteína NifH soluble en el estroma de los cloroplastos. La proteína NifH purificada a partir de cloroplastos de tabaco fue activa siempre que se co-expresara junto a NifU y NifS. El mismo conjunto de genes de A. vinelandii se rediseñó para aumentar la acumulación de sus proteínas en Oryza sativa y los péptidos de tránsito se probaron para determinar su eficacia en la importación de una proteína marcadora a plastidios de diferentes tejidos de arroz. Los péptidos de tránsito de A. thaliana seleccionados también fueron capaces de mediar la importación de las proteínas Nif a cloroplastos de hojas de arroz. NifM también resultó necesaria para la solubilidad de NifH en arroz. Sin embargo, no pudimos obtener plantas transgénicas de arroz que acumularan proteínas Nif en cloroplastos y, por lo tanto, la actividad NifH en cereales sigue siendo una incógnita. En conjunto, presentamos una prueba de concepto del uso de cloroplastos para albergar nitrogenasa, y un procedimiento de optimización para expresar cualquier transgen codificado en el núcleo dirigido a plastidios de N. benthamiana y O. sativa, centrándose en el diseño de versiones sintéticas de genes que confieren una mayor acumulación de proteína y caracterizando un conjunto de péptidos de tránsito que dirigen de manera eficiente sus proteínas transportadas mientras minimizan los aminoácidos remanentes en la proteína madura tras la importación.